Les agents spéciaux du FBI Fox Mulder (David Duchovny) et Dana Scully (Gillian Anderson) sont les enquêteurs travaillant sur des dossiers non classés (les « X-Files »), des affaires non résolues impliquant des phénomènes paranormaux. Mulder croit en l’existence des extraterrestres et au paranormal, alors que Scully, médecin et plus sceptique, est affectée pour faire des analyses scientifiques sur les découvertes de Mulder, afin de l’amener à revenir vers des conclusions habituelles du FBI⁴. Au cours de ces enquêtes, ils seront confrontés à des monstres, des événements surnaturels, des conspirations et des phénomènes ayant un lien avec les extraterrestres, présentés comme étant à l’origine de l’enlèvement de la sœur de Mulder, Samantha. Au début de la série, les deux agents deviennent des pions dans un conflit plus vaste, et sont amenés à ne faire confiance qu’à eux-mêmes. Ils développent une relation étroite qui débute par une amitié platonique, puis évolue au fil des saisons, tout cela sous l’œil constamment menaçant de l’inquiétant homme à la cigarette.

Cette série oppose en permanence le normal et le paranormal, le possible et l’impossible, le naturel et le surnaturel, le réel et l’irréel, grâce au scepticisme de Scully et à l’irrationalisme de Mulder.